Монастырь основан по указу Ивана Грозного от 10 февраля 1560 года новгородским архиепископом Пименом. Работами по устройству обители руководил богомольный новгородский ктитор Федор Сырков, который позже был казнен Иваном Грозным во время опричного погрома Новгорода. Срокам строительства придавалось особое значение, поэтому царь разрешил использовать крестьян из 20 волостей для всех видов работ.

Главная реликвия монастыря — Тихвинская икона Божией Матери Одигитрии. По преданию, ее написал святой апостол и евангелист Лука еще при жизни Девы Марии. В 1383 году икона чудесным образом появилась в окрестностях Тихвина на берегу реки Тихвинки. В тот же день на месте явления началось строительство деревянного храма Успения Пресвятой Богородицы. Однако на следующий день основание храма и икона исчезли и появились на другом берегу реки. После этого Богородица явилась пономарю Георгию и повелела поставить на храме деревянный, а не железный крест.

В 1510 году по повелению великого князя Василия III началось возведение каменного соборного храма на месте деревянного. Строительство завершилось в 1515 году. В это же время на месте явления Богородицы пономарю Георгию был основан малый Николаевский Беседный монастырь, который существовал до 1859 года.

В XVI веке кроме Успенского собора в монастыре были возведены и другие каменные постройки: трапезная с церковью Рождества Богородицы, святые ворота с надвратной церковью Вознесения и приделом Феодора Стратилата, пятишатровая звонница.

В 1613 году монастырь был осажден шведской армией под предводительством Якоба Делагарди. Защитники во главе с князем Семеном Прозоровским смогли отразить несколько штурмов и удержать обитель до прихода подкрепления.

В 1623 году Успенский собор пострадал от пожара, но был обновлен к 1624 году. Тогда же в соборе был устроен новый иконостас, который в 1794 году отделали червонным золотом.

В 1747 году императрица Елизавета Петровна распорядилась выстроить вокруг монастыря каменную ограду. Ее строительство началось в 1766 году, а завершилось в 1795 году благодаря пожертвованиям императоров Павла I и Александра I, а также средствам монастыря.

С наступлением эпохи классицизма почти все монастырские сооружения были перестроены в соответствии с новыми вкусами.